Karlshorst ist mit dem öffentlichen Personennahverkehr am besten über die S-Bahn-Linie S 3 zu erreichen. Der nach dem Stadtteil benannte Bahnhof liegt ungefähr auf halber Strecke der Bahn, die von Erkner am äußersten östlichen Rand Berlins bis zum Ostbahnhof verkehrt.
Für den Individualverkehr sind vor allem die beiden Hauptverkehrsadern Treskow- und Waldowallee von Bedeutung, die Karlshorst mit dem Berliner Straßennetz verbinden. Desweiteren ist der Stadtteil hervorragend an das Straßenbahnnetz angeschlossen.